Terapia Epigenómica en el Cáncer

•  Título del artículo: 
• Panorama transcripcional y utilidad clínica de los ARN potenciadores para la terapia dirigida al ARN potenciadores (enhancers RNAs) en el cáncer.
• Tema del artículo: 
• Este artículo se centra en los ARN potenciadores (eRNAs), un tipo de ARN no codificante, que actúan en la regulación de la expresión génica en el cáncer. De esta manera, se hace un análisis del perfil transcripcional de estos eRNAs y en su posible uso clínico como objetivos terapéuticos, con el fin de modificar la expresión génica asociada a la oncogénesis y la progresión del cáncer.
• Mecanismo epigenómico tratado: 
• Regulación por eRNAs: Los ARN de potenciación (eRNAs) regulan la expresión génica facilitando la interacción entre potenciadores y promotores. Estabilizan la estructura tridimensional del ADN, mejorando la eficiencia del ensamblaje de factores de transcripción y complejos reguladores en los sitios de unión del ADN.
• Modificación de histonas: Las modificaciones post-traduccionales de histonas, como la acetilación y la metilación, afectan la expresión génica. Los eRNAs influyen en estas modificaciones al reclutar complejos que alteran la cromatina, facilitando o inhibiendo el acceso a los promotores.
• Metilación del ADN: La metilación del ADN en regiones promotoras suele silenciar genes. Los eRNAs pueden promover la desmetilación de regiones promotoras, facilitando la activación de genes relacionados con el cáncer y contribuyendo a la proliferación y supervivencia celular tumoral.
• Tridimensionalidad del ADN: Los eRNAs contribuyen con la organización tridimensional del genoma en la formación de bucles de ADN que acercan potenciadores a promotores, un proceso esencial para la activación de genes específicos.
• Epitranscriptómica: Las modificaciones en los eRNAs pueden afectar su estabilidad, su capacidad para interactuar con proteínas y su función en la regulación de la transcripción.
• ¿Cómo se lo hizo?:
• Secuenciación de ARN de Alta Resolución (RNA-seq): Para identificar y cuantificar la expresión de eRNAs en diferentes muestras de cáncer y comparar su perfil transcripcional con tejidos normales.
• Edición genómica con CRISPR-Cas9: Utilización de tecnologías de edición genética para modular específicamente la expresión de eRNAs, para observar los efectos en la expresión génica y en el comportamiento de las células cancerosas.
• Epifármacos: Utilización de epifármacos relacionados con las vías de respuesta a los mismos y las vías de señalización del cáncer para la evaluación de la progresión y su repectiva eficacia. 
• Resultados: 
• Se identificaron eRNAs asociados con vías de señalización específicas del cáncer y que pueden influir en la respuesta a tratamientos. Estos, además de regular genes, están implicados en la modulación de puntos de control inmunitarios, lo que sugiere su potencial en la terapia inmunológica.
• También, los hallazgos sugieren que los eRNAs pueden ser utilizados como biomarcadores para predecir la respuesta a tratamientos y como dianas terapéuticas en el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento para el cáncer.

Técnicas de Edición de Ácidos Nucleicos en la Distrofia Muscular de Duchenne.

• Tipo de Edición: 
• In vivo.
• Somáticas.
• Dirigido hacia: 
• ADN: Gen DMD, que codifica la proteína muscular distrofina. 
• Dirigido por:
• gRNA (Guía de ARN)
• CRISPR-CAS9
• Vectores adenovirales "all-in-one", para la formación de complejos AdV.Cas9

Figura 1. Transducción AdV “todo en uno” de RGN pareados para la reparación de DMD a través de deleciones intragénicas de largo alcance. Obtenida de: https://www.nature.com/articles/srep37051#Fig3

Figura 2. Transducción AdV “todo en uno” de RGN pareados para la reparación de DMD a través de deleciones intragénicas de corto alcance. Obtenida de: https://www.nature.com/articles/srep37051#Fig2

• Órgano a tratar:
• Principalmente, músculos esqueléticos. 
• Vía de administración:
• Parenteral: Inyección intramuscular, para facilitar la transducción.
• Resultados:

• A corto plazo (1 año): Se evidencia una restauración parcial de la síntesis de distrofina en las células musculares tratadas. Este resultado indica que la edición genética es efectiva para corregir las mutaciones en el gen DMD e iniciar la producción de la proteína distrofina, que es esencial para la función muscular. Sin embargo, la eficacia en todos los tejidos musculares y la amplitud de la expresión de distrofina pueden ser limitadas.

• A mediano plazo (3 años): Mediante evaluaciones continuas de la eficacia del tratamiento, incluyendo estudios de seguimiento para medir la expresión de distrofina y la funcionalidad de los músculos, se manifiesta una mejoría en la fuerza y en la capacidad funcional, induciendo a la estabilización de la progresión de la enfermedad, con una reducción de la degeneración muscular. 

• A largo plazo (5 años): Se anticipa que el tratamiento genere beneficios sostenidos en la calidad de vida de los pacientes, con una mejora significativa en la función muscular y una posible disminución intervenciones médicas adicionales, además de un menor deterioro muscular en comparación con pacientes no tratados. Finalmente, se buscar establecer la seguridad a largo plazo del tratamiento y su impacto en la progresión de la DMD.

Terapia con Stem Cells en las lesiones traumáticas de médula espinal.

Administración intratecal de células madre mesenquimales
derivadas del tejido adiposo en la lesión traumática de la médula espinal.

• Objetivo: Evaluar la seguridad de la administración intratecal de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (AD-MSCs) en pacientes con lesiones traumáticas en la médula espinal, explorando los posibles beneficios terapéuticos de estas, como mejoras en la función motora y sensorial. 

• Tipo de Stem Cell: Células madre mesenquimatosas derivadas del tejido adiposo (AD-MSCs).

• Método de Obtención: Las células se obtienen del tejido adiposo del propio paciente y se utilizan por su capacidad de diferenciarse en varios tipos de células y su potencial para modular la respuesta inmune.

• Primero, se obtiene el tejido adiposo, a partir de una liposucción/biopsia mediante una pequeña incisión en el abdomen o el muslo del paciente.
• A continuación, el tejido graso recolectado se procesa. En primera instancia, se somete a digestión enzimática para aislar la fracción vascular estromal (que contiene a las células madre mesenquimatosas). 
• Se realiza el cultivo de las células aisladas (por aproximadamente 4 semanas). El cultivo se expandió hasta obtener alrededor de 100 millones de células. 
• Finalmente, las AD-MSCs se preparan en una solución adecuada para su administración al paciente.

• Vía de Administración: Inyección intratecal. Las AD-MSCs se inyectan en la región lumbar, accediendo al espacio intratecal o subaracnoideo (alrededor de la médula espinal) bajo guía fluoroscópica. Esta vía permite que las células madre lleguen directamente al sistema nervioso central.

Imagen obtenida de: https://www.nature.com/articles/s41467-024-46259-y#Fig1

• Resultados:
• A corto plazo: Se monitorearon los pacientes para detectar eventos adversos. No se reportaron complicaciones o reacciones graves, aunque se observaron algunas manifestaciones no graves como dolor de cabeza y dolor musculoesquelético en algunos pacientes, tratándose con medicamentos de venta libre que solucionaron los malestares.

• A mediano plazo: Posteriormente, se evaluó la función neurológica de los pacientes. Siete de los diez pacientes mostraron mejoras en su grado en relación con la Escala de Impedimento de la Asociación Americana de Lesiones de la Médula Espinal (AIS) en comparación con su estado previo a la inyección. Además, se observaron mejoras motoras y sensoriales.

• A largo plazo: Los pacientes continuaron siendo evaluados. La mayoría mantuvo o mejoró su grado AIS, lo que sugiere que la inyección de AD-MSCs puede tener efectos duraderos en la mejora de la función neurológica. Además, todos los pacientes con lesiones completas de la columna torácica, recuperaron algo de sensibilidad y control del movimiento. Por otro lado, en general, se pudo observar las siguientes mejorías: Aumento de la sensibilidad al pinchar con un alfiler y tocar con suavidad, un aumento de la fuerza en los grupos musculares motores y la recuperación de la contracción anal voluntaria, que ayuda a la función intestinal. 

• Avances logrados: Es posible mencionar que este tipo de células madre siguen siendo estudiadas, ya que estos primeros resultados son recientes. Sin embargo, con investigaciones de esta índole se ha confirmado que son seguras para ser administradas. Al utilizarlas y combinarlas con otras terapias, permiten mejorar la actividad motora (fortalecimiento muscular y mayor control del movimiento) y sensorial (tacto especialmente), en pacientes con lesiones medulares, sugiriendo potenciales efectos regenerativos del tejido medular. Los resultados obtenidos son fundamentales ya que, en estos casos, hasta un avance mínimo mejora de gran manera la calidad de vida, por lo que actualmente se está trabajando con un grupo de pacientes más grande. 

Animal transgénico para uso en medicina

•  Tema: Expresión del gen del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B en ratones transgénicos. 
• Tipo de animal transgénico: Ratones transgénicos TG [0HBs] CB que expresan el gen que codifica el antígeno de superficie de HBsAg. [1]
• Método de obtención: 
• Tipo: ADN recombinante (microinyección pronuclear/recombinación homóloga).
• Procedimiento:
1. Aislamiento del gen que codifica para el HBsAg del genoma del virus de la hepatitis B.
2. Insertar el gen en el vector (plásmido pUc-19), resultando el plásmido pUcHVB. [1]
3. Las copias del plásmido fueron microinyectados en embriones unicelulares de ratonas B6D2F1. [1]
4. Los óvulos microinyectados se implantan en el útero de ratones hembra pseudopreñadas para permitir el desarrollo embrionario. [1]
5. Las crías resultantes se examinan para determinar la presencia del gen HBsAg en su código genético mediante Southern Blot, Dot Blot o PCR. [1]
• Resultado: De 301 embriones, se detectó el gen de la HBsAg en doce ratones. 
• Aplicación: Estos modelos de animales transgénicos ayudaron a estudiar la patogénesis de la hepatitis B, es decir, el mecanismo de acción del virus, y las enfermedades hepáticas asociadas. Además, dieron indicios para entender la respuesta inmunitaria al HBsAg. Esto es fundamental, pues permite evaluar la eficacia de posibles terapias antivirales y vacunas. [1]

• 5 ventajas y 5 desventajas de los transgénicos.

Ventajas:

1. El auge de los organismos genéticamente modificados, permitió que, en el ámbito médico, sea posible conocer de mejor manera los mecanismos de las enfermedades, así como se dio el desarrollo de nuevos fármacos, vacunas y anticuerpos. [2]
2. Fue posible proporcionar a las plantas características de resistencia ante plagas e insectos, así como también, economizar la inversión agrícola al usar menos insecticidas o pesticidas, mismos que pueden resultar tóxicos para la humanidad. [2]
3. Los alimentos poseen mayor aporte nutricional, como sucede con el arroz dorado (rico en beta carotenos), que actúa como fuente de vitamina A. [2]
4. Su desarrollo fomentó el aprovechamiento de los recursos, pues ahora es posible utilizar áreas donde no se podía sembrar, ya que los suelos pueden ser enriquecidos y las plantas modificadas para adaptarse a condiciones de salinidad o sequías. [2]
5. Uno de los más grandes aportes fue la creación de plantas biorreactoras, o fábricas vivas, con el fin de producir sustancias de interés biológico, como proteínas, anticuerpos o compuestos biofarmacéuticos. [3]

Desventajas:

1. Algunos transgénicos representan un riesgo para la salud humana al causar o predisponer la manifestación de reacciones alérgicas nuevas y de hipersensibilidad. [2]
2. Su desarrollo puede generar resistencia a los antibióticos de microorganismos que infectan al ser humano, con graves consecuencias sobre la salud, o gérmenes que afectan la producción ganadera o avícola. [2]
3. Los cultivos resistentes pueden reducir a población de mosquitos e insectos, afectando los ecosistemas, además, es posible que se desarrollen supermalezas que sean muy difiíciles de controlar.[2]
4. Puede ocurrir contaminación genética desde las especies introducidas a un ecosistema a las especies nativas, debido a mecanismos como la polinización cruzada. [2]
5. Incremento en el desarrollo de enfermedades debido a los nuevos productos transgénicos, como la lectina aglutinina de Galanthus nivalis, que produce proliferación de la mucosa gástrica y cambios ultraestructurales en la mucosa intestinal. Otro ejemplo es la soya transgénica, quien induce cambios bioquímicos y fisiológicos en los hepatocitos. [2]

Referencias:

1. Castro, F. O., Pérez, A., Aguilar, A., De la Riva, G., Martinez, R., De la Fuente, J., & Herrera, L. Expresión del gen del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B en ratones transgénicos. Interferón y Biotecnología. [Internet]. 1989. [citado el 27 de julio de 2024]. Disponible en: https://elfosscientiae.cigb.edu.cu/PDFs/Biotecnol%20Apl/1989/6/3/p%20251%20-%20257%20.pdf

2. Tchernitchin, A. Organismos Transgénicos: Ventajas y Riesgos. Cuadernos Médico Sociales. [Internet]. 2004. [citado el 27 de julio de 2024]; 44(2). Disponible en: https://dialnet.unirioja.es/descarga/articulo/9510728.pdf

3. Menary J, Ritala A, Oksman-Caldentey KM, Schillberg S, Fischer R, Commandeur U. Plants as factories for biopharmaceuticals: a solution to present and future challenges? Biotechnol Lett. 2012. [citado el 27 de julio de 2024];34(8):1337-1352. Disponible en: https://link.springer.com/article/10.1007/s10529-012-0906-8

Generación de insulina artificial mediante ADN recombinante para el tratamiento de diabetes mellitus.

ADN recombinante artificial.

• Tema: Insulina humana obtenida por ADN recombinante a través de Escherichia coli para el tratamiento de diabetes mellitus tipo 1 y 2. [1]
• Objetivo: Obtener insulina recombinante a partir de E. coli, produciendo proinsulina mediante ADN recombinante y la selección de cepas de esta bacteria para su respectivo cultivo y procesamiento con el fin de formular insulina humana. [1]
• Gen o secuencia a clonar: Gen de la proinsulina, que luego se convertirá en insulina. [1]
• Enzimas de restricción: EcoR1. [1]
• Enzima ligasa: ADN ligasa. [1]
• Vector: Plásmido recombinante modificado pBR322. [1]
• Célula receptora: Procariota. E. coli 20, derivado de la cepa E. coli CSH50R, una de las variantes de E. coli K-12. [1]
• Mecanismo de transferencia o inserción del gen: 
• Transformación, es decir, la introducción del ADN recombinante (plásmido modificado) en la célula huésped (bacteria), mismo que se puede dar por choque térmico. [1] 
• Conjugación bacteriana. 
• Métodos de identificación de clones:
• Cultivo: Agar MacConkey-Sorbitol para cultivar E. coli durante la noche (a 37 grados C en pH neutro). Se puede agregar un antibiótico, como estreptomicina. [1]
• Cromatografía RP-HPLC: Analiza la pureza y la composición de la insulina recombinante. [1]
• Espectrofotometría: La concentración de proteína se midió a una longitud de onda de 280 nm. [1]
• Precipitación de insulina: Formación de un precipitado que se puede almacenar y usar en otras técnicas. [1]
• Reacción de citraconilación: El precursor de la insulina se trata con anhídrido citracónico para regular la digestión enzimática necesaria para formar la insulina y evitar su degradación. [1]

Ácidos nucleicos recombinantes en la naturaleza.

• ADN mitocondrial recombinante del maíz (Zea mays): En la naturaleza, la recombinación del ADN mitocondrial puede producir variantes genéticas que afectan la fertilidad, como sucede en algunas especies de maíz, ocasionando lo que se conoce como citoplasma estéril masculino (CMS). Esta condición impide la producción de polen viable debido a la recombinación de secuencias específicas en el genoma mitocondrial, dando la posibilidad de que aparezcan nuevas variantes genéticas con efectos genotípicos y fenotípicos diversos. [2]

Diagnóstico de cáncer de páncreas mediante secuenciación de nueva generación (NSG)

Las técnicas de secuenciación de nueva generación (NGS) representan un avance importante en el diagnóstico del cáncer de páncreas, ofreciendo la posibilidad de detectar y tratar la enfermedad en sus primeras etapas, desde la aparición de la primera alteración genética hasta el desarrollo del cáncer en estado avanzado. Entre ellas, la más destacada es la secuenciación completa del genoma y la secuenciación del exoma. En esta última, la fracción codificante de proteínas del genoma se captura y se secuencia de manera selectiva, permitiendo la identificación eficiente de las variantes que causan diferentes enfermedades. [1]

 Referencias:

1. Ochando-Noguera J, Díez-Díaz M. Diagnóstico del cáncer de páncreas mediante secuenciación de nueva generación (NGS). Nereis [Internet]. 2017 [citado el 23 de junio de 2024];(9):39–48. Disponible en: https://revistas.ucv.es/nereis/index.php/Nereis/article/view/90/73

Técnica de PCR para la detección de Hepatitis B.

La PCR es una herramienta fundamental para detectar el ADN del virus de la hepatitis B (VHB). El procedimiento implica la extracción de ADN del paciente en base a una muestra de suero o plasma, seguido de su amplificación mediante ciclos de temperaturas controladas. En este caso, se aplica una variante, la PCR en tiempo real, técnica que se fundamenta en la emisión de una señal fluorescente cada vez que un compuesto fluorescente se une a una secuencia diana durante la amplificación del ADN.  Así, la intensidad de esta señal aumenta proporcionalmente a la cantidad de ADN del VHB. De esta manera, se evalúa la replicación viral, la infección activa y la infectividad del paciente. 

• Tema: Cuantificación del virus de Hepatitis B por la técnica PCR en tiempo real.
• Objetivo: Diagnosticar de forma precisa y eficiente la infección por el virus de la hepatitis B (VHB), incluyendo la cuantificación de la carga viral, para un manejo adecuado de la enfermedad en sus diferentes estadios.
• Tipo de muestra biológica: Plasma humano (puede ser suero también), obtenido de una muestra de sangre recogida con anticoagulante EDTA.
• Tipo de ácido nucleico a ser extraído: El ácido nucleico extraído será el ADN del virus de la hepatitis B (VHB) presente en suero o plasma, que puede conseguirse mediante técnicas de amplificación del ácido nucleico o mediante tecnologías que amplifican la señal.
• Gen o secuencia a amplificar: Gen S que codifica al antígeno de superficie (HBsAg), el gen C a los antígenos HBcAg y HBeAg, el gen P a la polimerasa viral y  el  gen  X  que  regula  replicación  viral  y  la  transcripción  del  genoma.
• Tipo de PCR: PCR en tiempo real (RT-PCR). 
• Visualización: Esta cuantificación se realiza mediante el ensayo Abbott RealTime HBV, el cual amplifica un fragmento específico del genoma del VHB junto con un control interno para asegurar la precisión. La cantidad de ADN viral se mide mediante fluorescencia y se expresa en Unidades Internacionales (UI) o copias por mililitro. Es posible diagnosticar la infección por VHB, cuantificar la carga viral, la progresión de la enfermedad y el genotipo del virus para la selección del tratamiento antiviral adecuado.